8908180145 61 دانشگاه علوم پزشكي گلستان مركز تحقيقات عفوني
Immunomodulatory effects of genistein diet extracted from soy in treatment of tumor mice model of HPV-16 –induced cervical cancer بررسي قابليت تنظيم ايمني رژيم ايزوفلاون گياه جنيستئين در جهت مقابله با سرطان دهانه رحم ويروس پاپيلوما انساني تيپ 16- HPV-16)) در مدل موش تومور سرطان دهانه رحم يكي از سرطانهاي شايع در ميان زنان در كشور ما است. با وجود كسب مجوز براي استفاده از واكسن پيشگيري كننده “ گرادازيل” توسط كمپاني MERCK، استفاده از آن به لحاظ هزينه بالا و تامين آن براي جمعيت هدف با مشكلات عديده مادي مواجه است(1و2).
در سالهاي اخير توجه زيادي معطوف به طب سنتي در راستاي پيش گيري يا درمان بيماريها گرديده است; كه برخي ازين تركيبات گياهي، نويد بخش توسعه درمانهاي نويني در مسير علم پزشكي، بويژه در زمينه بيماريهاي عفوني بوده اند(3). يكي از چنين محصولاتي فرآورده هاي حاصل از عصاره گياه جنيستئين است.
بدليل اينكه رويكرد محققان به سمت درمانهاي جايگزين گياهي با منشا خوراكي معطوف گرديده است، مطالعات وسيعي بر روي فلاوونوئيدها انجام گرفته است.
فلاوونوئيدهاي گياهي التهاب و پاسخ هاي ايمني را از طريق مهارآنزيم هاي تنظيمي شركت كننده در متابوليسم واسطه هاي التهابي تخفيف مي دهند(4). دراين ميان مي توان از فلاونوئيدهاي سويا نام برد . جنيستئين (Genistein) از ايزوفلاون هاي اصلي سويا مي باشد كه از لحاظ ساختماني شبيه تعديل كننده هاي انتخابي رسپتور استروژن هستند. اخيرا بر روي خاصيت ضد سرطاني ايزوفلاوون هاي سويا در مطالعات آزمايشگاهي و باليني مختلف مطالعاتي صورت گرفته است و تنظيم و تعديل ايمني را بعنوان روشي در نظر گرفته اند كه جنيستئين ، اثر ضد سرطاني خود را اعمال مي كند(6و5). Th-2/ Th-1)). تأثير اين ماده بر سيستم ايمني در آرتريت روماتوئيد ، بيماريهاي نرودژنراتيو تحريك شده با استرس و ديابت نيز مشاهده شده است(7). همچنين اين ايزوفلاونوئيدها به كاهش سطح لپتين نيز كمك مي كنند. با توجه به اثر جنبستئين و دايدزئين بر تعديل سيستم ايمني و اثر ضد التهابي آن (8و9)، فرضيه اثر ضد توموري اين ماده بر عليه تومور ويروس پاپيلوما ويروس انساني تيپ 16 مطرح مي شود. بديهي است در صورت اثر بخشي اين مواد مي توان از نتايج اين مطالعه در آينده به عنوان يك راهكار عملي كم هزينه، قابل تحمل و با اثرات جانبي كم در درمان افراد مبتلا به اين نوع سرطان بهره جست. نظيم ايمني- ايزوفلاون -گياه جنيستئين -سرطان دهانه رحم- مدل موش توموري 1293926400 12 سرطان دهانه رحم يكي از سرطانهاي شايع در ميان زنان در كشور ما است.
با توجه به اثر جنبستئين و دايدزئين بر تعديل سيستم ايمني و اثر ضد التهابي آن (8و9)، فرضيه اثر ضد توموري اين ماده بر عليه تومور ويروس پاپيلوما ويروس انساني تيپ 16 مطرح مي شود. 1. ارزيابي واكنشهاي تكثير لنفوسيتي بدنبال ايمن سازي
2. ارزيابي ميزان آزاد سازي لاكتات دهيدروژناژ بدنبال ايمن سازي
3. ارزيابي سايتوكينهاي ايمني سلولي اينترفرون گاما بدنبال ايمن سازي فاز اول:
ايجاد مدل توموري در موشهاي C57BL/6
تهيه مقادير لازم از سل لاين ايجاد كننده تومور TC-1
كشت و تهيه تعداد مناسب سلولهاي توموري- توموري كردن موشهاي C57BL/6 با لاين سلولي-
بكار گيري موش توموري در راستاي آزمايشات
در مطالعات اوليه ميزان اوپتيمم سلول توموري TC-1 براي ايجاد تومور مورد بررسي قرار خواهد گرفت. كه اندازه گيري تومور بااستفاده از كوليس انجام مي گيرد.
رفرانس ايجاد تومور:
Protection of mice by a Lambda-based therapeutic vaccine against HPV16-associated cancer. Ghaemi A , Soleimanjahi H, Gill P, Hassan Z, Dinarvand R, Intervirology 2010


فاز دوم:
بكار گيري رژيم ايزوفلاون جنيستئين
1. بكار گيري رژيم ايزوفلاون گياه جنيستئين
3 گروه ده تايي از موشهاي ماده C57BL/6 6 تا 8 هفته اي انتخاب مي شوند كه به طور تصادفي به گروههاي تحت مطالعه ذيل اختصاص مي دهيم: دليل انتخاب 10 موش مشورت با مشاور آماري و سابقه چاپ مقالات مشابه با اين تحقيق از جمله-
1. Echinacea purpurea Polysaccharide Reduces the Latency Rate in Herpes Simplex Virus Type-1 Infections. Ghaemi A (Correspond Author), Soleimanjahi H, Gill P, Arefian E, Soudi S, And Hassan Z. Intervirology 2009;52:29–34.
به منظور تعيين اثر مداخله ها از 3 گروه استفاده شد كه 2 گروه توموري و يك گروه كنترل تومور مي باشد به صورت زير:
به گروه اول 2 هفته پس از توموري كردن به مدت 7 روز جنسيتئين (300 ميلي گرم به ازاء كيلوگرم وزن بدن)داده خواهد شد. به گروه دوم در موشهاي غير توموري به مدت 7 روز جنسيتئين و گروه سوم در موشهاي توموري از PBS بعنوان كنترل منفي بهره گرفته شد.
رژيم اوپتيمم براي ايزوفلاون در مطالعات اوليه صورت گرفته، تعيين شد. و نشان داده شد كه 300 ميلي گرم به ازاء كيلوگرم وزن بدن داراي بهترين توانايي براي ايمني سلولي مي باشد. ضمن اينكه از نظرات متخصص تغذيه (دكتر رازقي) نيز بهره گرفته شد، كه همين نتايج به اين مطالعه تعميم داده شد. در همين مطالعه، استخراج ماده موثره صورت گرفت و ماده مورد نظر آماده استفاده مي باشد.

فاز سوم:
اعتبار سنجي ايمونولوژيك


دو هفته پس از آخرين تيمار ارزيابيهاي ايمونولوژيك صورت مي گيرد.
سنجش تكثير لنفوسيتهاي جدا شده از موشها در محيط كشت سلولي: سه هفته پس از آخرين تيمار 5 موش را از هر گروه به صورت تصادفي انتخاب مي كنيم. حيوان را كشته، طحال را خارج مي كنيم. لنفوسيتهاي جدا شده را در شرايط in vitro در حضور و عدم حضور جنسيتئين تحريك مي نمائيم. سپس ، ميزان تكثير سلولي را برآورد مي نمائيم
تعيين توليد IFN-γ در اسپلينوسيتها با استفاده از كيت اليزا براي اندازه گيري سايتوكاين ها نيز به طريق مشابه پس از تحريك سلولهاي لنفوسيت جدا شده در محيط كشت سلولي پس از مواجهه با آنتي ژنها جنسيتئين سوپرناتانت را جمع آوري كرده و ميزان اينترفرون γ را با روش الايزا اندازه گيري مي كنيم. به اين ترتيب كه پليتهاي الايزا را با آنتي بادي منوكلونال عليه اينترفرون γ مي پوشانيم، سوپ را اضافه مي كنيم و سايتوكاين متصل شده توسط آنتي بادي بيوتنيليه كه نهايتا با پراكسيداز كونژوگه با استرپتوآويدين واكنش مي دهد، شناسايي مي شود (ساندويچ الايزا). با استفاده از كيت bioscience كه اناليزها با استفاده واكنش رنگ سنجش سنجي صورت گرفت. كه در مقايسه با گروه كنترل ارزيابي صورت مي گيرد.
ارزيابي سلولهاي CTL اختصاصي CTL assay)) بر پايه روش رنگ سنجي لنفوسيتهاي طحالي در مقابل تحريك ثانويه با آنتي ژن- كه براي اين منظور از آنتي ژن جنسيتئين براي تحريك استفاده مي شود. كه اناليزها با استفاده واكنش رنگ سنجش با استفاده از كيت Lactate dehydrogenese- bioscience از شركت بيوساينس صورت گرفت.




اندازه گيري سايز تومور براي ارزيابي كارايي ضد توموري تركيبهاي مختلف

سنجش ميزان تكثير لنفوسيتي با استفاده با كيت MTT assay bioscience
كه براي اين منظور از كيت سنجش تكثير لنفوسيتي تاكارا استفاده شدكه در داخل آن رنگ حياتي و ممحلولهاي شستشو و حلال قرار گرفته است 35000000 دانشگاه علوم پزشكي گلستان 1293926400 0 بلي بلي فعال و منتشر شده 1309910400